斑马鱼尿素循环基因表达

一、前言

　　大多数鱼体内氮的代谢产物是尿酸，也有部分鱼类在发育早期可以产生尿素。斑马鱼体内产生的尿素是否来自于尿素循环，如果是尿素循环，这个过程是如何调控，这个问题一直以来困扰着科学界。

　　本研究利用原位杂交技术和PCR方法检测了四种尿素循环主要酶的空间构象的基因表达：分别是CPSⅢ、鸟氨酸羧化转移酶(OCT)、精氨酸代琥珀酸合成酶和精氨酸代琥珀酸裂解酶。为了研究CPSⅢ酶的功能，使用吗啉代(一种目的基因抑制剂)来阻止斑马鱼胚胎中的CPSⅢ激活，以评估斑马鱼在发育过程中氮的代谢情况。

　　本研究进一步探索鱼类体内的尿素生成机制。斑马鱼的发育早期具有尿素生成的相关基因，本研究目标第一是评估发育中的斑马鱼胚胎内的尿素循环相关酶的转录表达方式。第二，假设CPSIII表达方式有差异，分别在斑马鱼的幼鱼和成鱼发育过程中检测尿素循环酶是如何利用不同的启动子。第三，利用吗啉代基因拆除发育中的斑马鱼的CPSIII表达，评估早期发育中尿素生成是否主要通过尿素循环，从而确定这种方式是否与鱼胚胎发育在生理学上相关。

二、方法

　　动物：野生斑马鱼作为亲鱼，通过标准培养程序获得受精卵及胚胎。

　　组织：选取受精后5、24、32、48和72小时的胚胎

　　原位杂交包埋：标有异羟基洋地黄毒苷的RNA探针进行克隆。

　　吗啉代基因抑制：吗啉代阻止CPSIII的第二个内含子从前mRNA转录中切除，并引入9个终止密码子。

三、结果

　　1、在最初受精后96小时内，所有的基因转录都有增加的倾向。CPSIII的mRNA在受精后24-32小时之间增加两倍，之后恢复到原来水平。其他酶转录开始时缓慢增加到受精后72~96小时之间显著增加(OTC和ASS1)。

　　2、在成鱼肝脏中，除了ASL，大多数酶的表达水平极低;成鱼的肌肉中尿素酶的转录与受精后24小时的幼鱼比较接近，ASL在成年鱼肌肉中的表达水平明显较高。

　　图1尿素循环mRNA在斑马鱼发育幼体和成年鱼中的表达。利用实时PCR分析评价CPSIII(A),鸟氨酸转移酶(OTC)(B),精氨酸琥珀酸盐合成酶(ASS1)，和精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)(D)的mRNA在发育中的斑马鱼体内的表达水平。

　　3、尿素循环酶的转录主要位于胚胎的内胚层，接近卵黄囊的前部;卵黄后躯干部位并没有发现明显的标记;在脑部的前端也检测到ASL和ASS1的酶转录，以及脑的最后部也检测到CPSIII和OTC的酶转录。

　　图2受精后32小时斑马鱼胚胎的尿素循环酶的空间表达。利用原位杂交技术来确定CPSⅢ(A),OTC(B),ASS1(C),ASL(D)的具体表达位置。箭头指示的是胚胎内胚层各基因表达的位置。比例是1:微米。

　　4、CPSII酶活性不受吗啉代处理的影响(图3A);受精24h后，CPSIII酶活性降低了50%;受精48h后，CPSIII酶活性基本上恢复到得以表达的水平;不管注入何种吗啉代CPSIII酶活性在受精后24小时到48小时之间几乎翻倍。

　　图3CPSII和CPSⅢ分别在发育控制(白条)和CPSⅢ吗啉代有机物(黑条)中的酶活性。分别评价了斑马鱼胚胎在受精后24小时和48小时的CPSII(A)和CPSⅢ(B)的相对酶活性。

　　5、在发育72h内，氨排泄物明显增加(图4A)。CPSIII和吗啉代溶剂中的氨排泄率差异不显著;受精后30~48h，吗啉代溶剂中的氨排泄增加，受精58h后明显降低(图4A)。相反，在发育过程中，所有的尿素排泄物都变化更加多样化(图4B);受精后24~30h，CPSIII有机物中没有排泄明显的尿素。

　　6、受精后24~48h，鱼体中CPSIII和受调控吗啉代有机物之间的氨含量没有明显差异(图4C);受精后24h，CPSIII有机物中的尿素含量比受调控有机物中的尿素含量低10倍，这种差别在受精后48h消失(图4D)。

　　图4发育控制中和CPSⅢ吗啉代有机物中的氮变化和体内含量。受调控的吗啉代有机物(白条)和CPSⅢ吗啉代有机物(黑条)用来评估不同发育阶段氨(A)和尿素(B)的排泄，以及氨(C)和尿素(D)的总含量。

　　7、受精后24h将吗啉代注入卵黄囊，检测其含氮排泄物。2h后CPSIII有机物和受调控吗啉代有机物都排泄有大量尿素(图5A)，CPSIII有机物排泄的尿素量占调控吗啉代有机物的一半(图5A)。在鱼体内，CPSIII有机物中含有较高的氨，尿素含量却远低于受调控的吗啉代有机物(图5B)。总体来说，CPSIII吗啉代比受调控吗啉代排泄和积累的尿素少，比受调控吗啉代排泄和积累的氨多。

　　图5注入氨的受调控有机物和CPSⅢ吗啉代有机物中氮变化和总含量。受调控的吗啉代有机物和CPSⅢ吗啉代有机物中的卵黄囊被注入氨，对氨和尿素的排泄率进行了2个小时的评估(A)，并对其总体含量进行分析(B)。

四、结论

　　1、通过氨注射结果分析，发现斑马鱼早期发育时期尿素循环酶的mRNA在胚胎内胚层有一定的表达。

　　2、胚胎时期的CPSⅢ启动子的甲基化与幼鱼和成年鱼组织内的表达方式不一致，意味着这种酶存在其他方式的转录调节。

　　3、CPSⅢ的基因学在受精后24小时表现出暂时性CPSⅢ酶活性降低，同时伴随着发育过程中尿素生成的减少。

　　综上所述，斑马鱼酶转录的位置说明最佳位置是在胚胎的卵黄区域。本研究为许多硬骨鱼在早期发育阶段具有尿素循环排毒能力这一观点提供了新的证据，只是硬骨鱼的尿素循环能力在后期发育中受到了抑制。

　　本文由亚太兴牧供稿，摘自《Ontogenyofornithine-ureacyclegeneexpressioninzebrafish》一文，作者ChristopheM.R.LeMoineandPatrickJ.Walsh，发表于AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol:R–R0,.

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